单细胞靶向蛋白功能性用于CAR-T细胞质量评估

CAR-T疗法正在改变肿瘤治疗的前景，但其生产本身也面临一系列挑战。与大多数药物不同，由于CAR-T疗法使用患者自己的T细胞，是高度个性化的，细胞治疗产品的质量在批次和患者之间存在显著差异。在开发过程中，最重大的挑战之一是表征制备CAR-T产品的质量和效力。IsoPlexis单细胞蛋白组学技术帮助研究者很好的迎接这方面的挑战。

IsoPlexis技术评价单细胞的多功能性，根据其功能定义细胞的质量

IsoPlexis系统检测每个单个细胞分泌的特定细胞因子，并识别多功能细胞和细胞亚群（那些细胞分泌两个或更多细胞因子），这些亚群在多种研究和疾病治疗相关。IsoPlexis平台还可以在表型相同的样本中检测到细胞功能异质性，这些细胞及其异质性带来的特质会被流式技术或群组检测的技术忽略（图1）。IsoLight全自动单细胞蛋白质组学分析系统对细胞功能深度分析，文献数据显示与患者临床结果关联，未来可成为细胞治疗产品的疗效预判与监控。

图1. 表型相同的细胞，表现出功能的异质性

应用案例

在这里，我们讨论了一个研究案例，研究人员使用了Miltenyi自动化系统进行上游的靶向CD19/CD22双特异性CAR-T制备，接着使用IsoLight单细胞分析平台进行下游的细胞功能质量评估。研究人员采用了两种生产制备方法，对比了不同的方法制备的CAR-T细胞的差异（图2）。第一种方法（M1）在第5天以洗涤步骤终止转染，而第二种方法（M2）在第3天终止转染。

复苏的CAR-T细胞用抗CD4或抗CD8磁珠分选，并与表达CD19或CD22抗原的靶细胞共培养。去除靶细胞后，将CAR-T细胞悬液载入IsoCode单细胞蛋白质组芯片，捕获单细胞的细胞因子信号，数据使用IsoSpeak软件进行分析。结果表明，无论是靶向CD19还是CD22的CAR-T细胞，使用M2方法制备得到的细胞，细胞多功能指数更高(图3上)；CD4+（左）和CD8+（右）CAR-T产品中，使用M2方法制备的细胞，多功能细胞的占比更高(图3下)。即使用M2制备的CAR-T产品表现出更高的多功能性，也表现在效应性因子和刺激性细胞因子的增加。这一单细胞多功能数据清楚地表明，与之前使用的M1相比，M2显著改善了双特异性CD19/CD22 CAR-T细胞产品的功能。

图3. PSI和细胞多功能性是评价细胞功能的标尺

精确的功能质量分析在CAR-T制备的重要性

在评价CAR-T产品评价过程中，细胞数量和活力的增加并不总是与细胞功能的增强跟最终治疗效果正相关。上述研究使用IsoSpeak多维生信分析软件，细胞多功能指数(Polyfunctional Strength Index PSI)对这两种方法进行了评价。PSI同时涵盖了细胞因子分泌的广度(多功能，即分泌两个或更多细胞因子的单个CAR-T细胞)和细胞因子分泌的强度（分泌量）。PSI可以作为独特的标尺在治疗应用之前评估细胞产品的效力。早在2018年一篇Blood文章中研究了治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)靶向CD19 CAR-T细胞，检测了在输注前CAR-T细胞的多功能性及PSI指数，并发现与临床结果有正相关性。研究表明，这些患者输注前CAR-T的多功能性与患者接受治疗后的客观反应(OR)和细胞因子释放综合征(CRS)具有统计学正相关性，通过单细胞体外实验能够预测临床治疗结果及不良反应。PSI可以有效区分对治疗有应答者和无应答者。

自动化端到端(End-to-end)工作流程的数据稳定性

考虑到细胞治疗产品生成跟品质，细胞治疗行业从细胞处理工作流程，细胞分离、细胞培养到最终细胞产物的配方都需要更多自动化的流程。IsoPlexis的IsoLight单细胞因子检测系统采用全自动检测的工作方式，包含细胞培养，捕获因子信号，多重因子检测，影像数据读取及导出。简单直观的IsoSpeak多维生信分析软件，无需特别培训生信分析人员来进行数据分析。大幅提高工程细胞产品开发和流程的优化。

参考文献：